皮肤致敏体外方法：动力学直接多肽反应试验方法（kDPRA）的转化与验证

doi:10.3969/j.issn.2097-2806.2025.06.006

摘要/Abstract

摘要：

皮肤致敏体外方法动力学直接多肽反应试验方法（kDPRA）是模拟皮肤致敏有害结局通路（AOP）的第一个关键事件（KE1），即亲电物质与皮肤蛋白亲核中心的共价结合；基于待测物对含有半胱氨酸的合成模型肽的反应性，通过检测6个时间点肽与不同浓度待测物孵育后的剩余量，计算待测物的最大反应速率常数的对数lg k_max，从而识别强致敏性物质（GHS 1A）。国内目前尚无该方法的报道。文章考察了不同品牌单溴代二苯甲烷对试验的影响，并选择7种已知致敏性的化合物，验证kDPRA方法预测准确性。结果表明，不同品牌单溴代二苯甲烷对预测结果影响在可接受范围；7种物质致敏性预测结果与已知分类一致。kDPRA方法可以准确识别强致敏物质。

关键词: 皮肤致敏, 体外, 动力学直接多肽, 验证

Abstract:

The in vitro method kinetic direct peptide reactivity assay （kDPRA） for skin sensitisation is the first key event （KE1） for modelling the skin sensitisation adverse outcome pathway （AOP）: covalent binding of electrophilic substances to nucleophilic centres of skin proteins. Based on the reactivity of tested substance and cysteine, the logarithm of the maximum rate constant （lg k_max） of the tested substance was calculated by detecting the amount of peptide remaining after incubation with different concentrations of the tested substance at six time points, which is used to support the discrimination of UN GHS subcategory 1A skin sensitisers （GHS 1A）. This method has not yet been reported in China. The effect of different fluorescence efficacy monobromobimane on the test was examined. Seven compounds with known sensitising strengths were selected to validate the predictive accuracy of the kDPRA. The results show that the effect of different brands of monobromobimane on the prediction results can be accepted. The prediction of allergenicity for the 7 substances is consistent with the known classification, and that kDPRA can accurately identify the subcategory 1A skin sensitisers.

Key words: skin sensitisation, in vitro, kinetic direct peptide reactivity assay, validation

中图分类号:

TQ658

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图/表 6

表 1

表 2

图 1

图 2

表 3

表 4

7个化合物kDPRA方法致敏性预测结果"

化合物	时间/min		10	30	90	150	210	1 440	预测结果
T1	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	53.79	93.36	99	99	99	99	1A
		2.50 mmol/L	21.9	72.05	94.46	98.32	98.49	99
		1.25 mmol/L	9.07	47.6	74.67	87.1	84.59	99
		0.63 mmol/L	4.54	20.67	48.96	66.07	51.58	99
		0.31 mmol/L	1.56	5.2	26.8	43.33	23.92	63.85
	相关系数R^#	0.985 6	0.999 6	0.990 6	0.999 9	0.999 5	1
	k_observedR²	0.981 4
	lg [k_t / （mol/L/s）]	-0.57	-0.5	-0.77	-0.75	-0.84	-0.88
T2	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	78.46	96.97	98.81	97.95	96.44	88.29	1A
		2.50 mmol/L	51.74	92.44	94.69	93.46	88.82	74.13
		1.25 mmol/L	26.08	72.87	84.67	81.03	73.87	59.46
		0.63 mmol/L	7.23	45.47	53.18	53.28	45.36	34.68
		0.31 mmol/L	1	27.41	33.27	35.5	29.77	31.04
	相关系数R^#	0.999 7	0.968 9	0.977 6	0.974 3	0.983 4	0.989 7
	k_observedR²	0.408 1
	lg [k_t / （mol/L/s）]	-0.26	-0.42	-0.81	-1.09	-1.3	-2.35
T3	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	4.1	22.38	26.14	50.66	53.03	94.51	1A
		2.50 mmol/L	1	11.78	16.99	32.81	28.85	80.37
		1.25 mmol/L	3.8	7.71	5.35	23.72	13.97	60.28
		0.63 mmol/L	2.5	1.89	1	7.67	5.46	36.62
		0.31 mmol/L	9.9	1	1	6.23	2.35	32.86
	相关系数R^#		0.994	0.985 5	0.988 2	0.999 3	0.998 3
	k_observedR²	0.964 3
	lg [k_t / （mol/L/s）]		-1.54	-1.91	-1.82	-1.9	-2.2
T4	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	87.86	70.89	63.72	59.12	66.15	78.65	1A
		2.50 mmol/L	80.63	56.56	59.45	57.22	64.51	77.01
		1.25 mmol/L	69.76	43.62	61.47	59.78	64.24	80.97
		0.63 mmol/L	55.86	41.95	58.84	53.46	62.21	80.68
		0.31 mmol/L	49.83	44.8	61.22	56.66	62.48	84.31
	相关系数R^#	0.972 6	0.979 6	0.667 8	0.522 7	0.941 9	0.684
	k_observedR²	-0.803 5
	lg [k_t / （mol/L/s）]	-0.3	-1.08			-2.75
T5	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	1	1	1	1	7.3	60.22	Non-1A
		2.50 mmol/L	1	1	1	1	3.1	31.08
		1.25 mmol/L	7.4	1	1	1	11	13.39
		0.63 mmol/L	3.9	1	1	1	8.2	5.59
		0.31 mmol/L	15.3	1	1	1	11.8	2.55
	相关系数R^#						0.996
	k_observedR²
	lg [k_t / （mol/L/s）]						-2.65
T6	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	1	1	1	1	1	1	Non-1A
		2.50 mmol/L	1.2	1	1	1.6	1	1
		1.25 mmol/L	1	1	1	1	1	1
		0.63 mmol/L	1	1	1	1.8	1	1
		0.31 mmol/L	3.8	1	2.4	3.2	1	1
	相关系数R^#
	k_observedR²
	lg [k_t / （mol/L/s）]	无反应
T7	相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	1	1	1	1	1	1	Non-1A
		2.50 mmol/L	1	1	1	1	1	1
		1.25 mmol/L	1	1	1	1	1	2.3
		0.63 mmol/L	1	1	1	1	1	2
		0.31 mmol/L	2.3	3.6	1	6.2	1	3.3
	相关系数R^#
	k_observedR²
	lg [k_t / （mol/L/s）]	无反应

表 4

参考文献 17

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	E/（mmol/L）	T_PC1（m1）			T_PC2（m2）			T_PC3（m3）			RSD
VC		5.6×10⁸	5.5×10⁸	5.7×10⁸	7.4×10⁸	8.4×10⁸	7.2×10⁸	7.6×10⁸	8.1×10⁸	8.3×10⁸
BC		1.7×10⁷	1.8×10⁷	1.7×10⁷	5.4×10⁶	5.4×10⁶	5.0×10⁶	4.4×10⁶	4.8×10⁶	4.9×10⁶
T_PC校正剩余肽	0.310	4.4×10⁸	4.3×10⁸	5.5×10⁸	6.1×10⁸	7.0×10⁸	6.9×10⁸	7.9×10⁸	8.6×10⁸	8.7×10⁸
	0.63	4.2×10⁸	4.4×10⁸	4.8×10⁸	6.2×10⁸	6.7×10⁸	6.2×10⁸	8.1×10⁸	8.0×10⁸	8.4×10⁸
	1.25	3.7×10⁸	4.4×10⁸	4.7×10⁸	5.8×10⁸	7.5×10⁸	5.0×10⁸	6.4×10⁸	7.1×10⁸	6.1×10⁸
	2.50	3.5×10⁸	4.5×10⁸	3.8×10⁸	4.6×10⁸	5.7×10⁸	4.3×10⁸	6.5×10⁸	6.1×10⁸	6.7×10⁸
	5.00	2.8×10⁸	4.5×10⁸	4.3×10⁸	3.9×10⁸	4.6×10⁸	4.0×10⁸	5.4×10⁸	5.1×10⁸	5.3×10⁸
T_PC相对剩余肽	0.310	0.81	0.80	1.02	0.80	0.92	0.91	1.00	1.07	1.09	0.10
	0.63	0.78	0.81	0.89	0.81	0.88	0.81	1.02	1.00	1.06	0.11
	1.25	0.68	0.82	0.87	0.76	0.98	0.66	0.80	0.89	0.76	0.01
	2.50	0.64	0.83	0.70	0.61	0.75	0.57	0.82	0.77	0.84	0.08
	5.00	0.53	0.83	0.80	0.52	0.61	0.53	0.67	0.63	0.67	0.09

时间/min		10	30	90	150	210	1 440
相对肽消耗/%	5.00 mmol/L	1.00^*	19.38	43.34	60.67	63.44	50.11
	2.50 mmol/L	1.00^*	1	18.39	42.23	43.58	40.43
	1.25 mmol/L	1.00^*	3.64	15.38	27.85	26.7	29.38
	0.63 mmol/L	1.00^*	9.83	5.56	12.34	13.21	19.71
	0.31 mmol/L	1.00^*	2.92	3.05	5.24	4.37	8.64
VC的CV/%	10.75	11.27	10.78	12.03	11.96	11.32
相关系数R^#		0.712 8	0.983 2	0.991 3	0.995 2	0.957 6
k_observed的R²	0.955 5
lg [k_t / （mol/L/s）]		^△	-1.69	-1.69	-1.8	-2.86

化合物	物理状态	溶剂	UN GHS LLNA	UN GHS 人体
T1	固体	乙腈	1A	1A
T2	固体	乙腈	1A	无数据
T3	液体	乙腈	1A	1A
T4	固体	PB	1A	1A
T5	液体	PB	1B	1B
T6	固体	乙腈	未分类	未分类
T7	液体	乙腈	未分类	未分类