化妆品微生物ATP生物荧光增幅检测技术的双培养体系构建及可行性研究

doi:10.3969/j.issn.2097-2806.2025.05.016

Abstract

Abstract:

To improve the microbial detection efficiency in cosmetics, an amplified ATP bioluminescence 24 h assay with dual enrichment system was established. Meanwhile, growth promotion test of an enrichment medium and product suitability test was carried out. 11 of slow-growing fungi, yeasts and bacteria were selected as representative strains, and the key parameters such as culture temperature and enrichment medium formula were optimized. The results show that the enrichment system that promoted fungal growth is TLE medium incubated at 25 ℃, and the bacterial enrichment system is MTAT medium incubated at 32.5 ℃. 32 representative strains relevant to raw materials and production environment of cosmetics are collected and tested. They all grow well in the enrichment system，and the results of amplified ATP bioluminescence 24 h assay are all positive. Subsequently, six kinds of cosmetics with different functional claims, use parts, production dosage forms and use methods are selected and inoculated with six reference strains recommended by Chinese Pharmacopoeia （2020） for product suitability test. The background values of the tested cosmetics meet the requirements of the detection method. Results of spiking test show that all the samples tested are positive. Therefore, amplified ATP bioluminescence 24 h assay has a promising application prospect in the rapid screening of microorganisms in cosmetic fields.

Key words: amplified ATP bioluminescence, cosmetics, dual enrichment system, growth promotion test, product suitability test

CLC Number:

TQ658

Ting Li, Ziying Ma, Jiquan Liu, Shenghui Cui, Yu Jing, Feirong Bai, Su Yao. Establishment and feasibility study of a dual enrichment system for amplified ATP bioluminescence microbial detection assay in cosmetics[J].China Surfactant Detergent & Cosmetics, 2025, 55(5): 668-676.

Figures/Tables 11

Tab. 1

The information of test strains"

序号	试验菌株	序号	试验菌株
1	洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia, FC 1395）	17	反色枝孢霉（Cladosporium inversicolor, 10073）
2	大肠埃希氏菌（Escherichia coli, CICC 10389）	18	黄色枝孢霉（Cladosporium xanthochromaticum, CICC 41761）
3	铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, CICC 10419）	19	耐盐枝孢霉（Cladosporium halotolerans, CICC 2443）
4	金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, CICC 10384）	20	异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus, CICC 1966）
5	枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis, CICC 10275）	21	藤黄微球菌（Micrococcus luteus, CICC 10269）
6	白色念珠菌（Candida albicans, CICC 1965）	22	迟缓芽胞杆菌（Bacillus lentus, CICC 10365）
7	胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa, CICC 31700）	23	荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescencei, CICC 21620）
8	黑曲霉（Aspergillus niger, CICC 2487）	24	大肠埃希氏菌（Escherichia coli, CICC 10303）
9	平滑正青霉（Eupenicillium levitum, CICC 41086）	25	大肠埃希氏菌（Escherichia coli, CICC 10304）
10	产黄青霉（Penicillium chrysogenum, CICC 40654）	26	大肠埃希氏菌（Escherichia coli, CICC 10361）
11	扩展青霉（Penicillium expansum, CICC 40658）	27	金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, CICC 24817）
12	黄曲霉（Aspergillus flavus, CICC 41630）	28	拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailli, CICC 1281）
13	桔青霉（Penicillium citrinum, CICC 41727）	29	聚多曲霉（Aspergillus sydowii, CICC 40930）
14	小孢根霉（Rhizopus microsporus, CICC 3146）	30	芽枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides, CICC 41760）
15	烟曲霉（Aspergillus fumigatus, CICC 41022）	31	树脂枝孢霉（Amorphotheca resinae, CICC 41706）
16	宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii, CICC 4025）	32	绳状青霉（Penicillium funiculosum, CICC 40279）

Tab. 1

Fig. 1

Tab. 2

Tab. 3

Tab. 4

Tab. 5

Tab. 6

Tab. 7

Tab. 8

Tab. 9

Growth promotion test results of 32 test strains"

序号	试验菌株	比值（样品RLU/培养基空白RLU）	检测结果	平板确认
1	洋葱伯克霍尔德氏菌（B. cepacia, FC 1395）	8 295.27	P	+
2	大肠埃希氏菌（E. coli, CICC 10389）	268.66	P	+
3	铜绿假单胞菌（P. aeruginosa, CICC 10419）	273 972.6	P	+
4	金黄色葡萄球菌（S. aureus, CICC 10384）	273 972.6	P	+
5	枯草芽胞杆菌（B. subtilis, CICC 10275）	273 972.6	P	+
6	白色念珠菌（C. albicans, CICC 1965）	476.76	P	+
7	胶红酵母（R. mucilaginosa, CICC 31700）	4.88	P	+
8	黑曲霉（A. niger, CICC 2487）	85.19	P	+
9	平滑正青霉（E. levitum, CICC 41086）	91.57	P	+
10	产黄青霉（P. chrysogenum, CICC 40654）	43.39	P	+
11	扩展青霉（P. expansum, CICC 40658）	154.82	P	+
12	黄曲霉（A. flavus, CICC 41630）	117.68	P	+
13	桔青霉（P. citrinum, CICC 41727）	162.19	P	+
14	小孢根霉（R. microsporus, CICC 3146）	7 853.89	P	+
15	烟曲霉（A. fumigatus, CICC 41022）	26.53	P	+
16	宛氏拟青霉（P. variotii, CICC 4025）	3.84	P	+
17	反色枝孢霉（C. inversicolor, 10073）	4.44	P	+
18	黄色枝孢霉（C. xanthochromaticum, CICC 41761）	4.98	P	+
19	耐盐枝孢霉（C. halotolerans, CICC 2443）	4.49	P	+
20	异常威克汉姆酵母（W. anomalus, CICC 1966）	1 825.31	P	+
21	藤黄微球菌（M. luteus, CICC 10269）	12.66	P	+
22	迟缓芽胞杆菌（B. lentus, CICC 10365）	156.96	P	+
23	荧光假单胞菌（P. fluorescencei, CICC 21620）	10 896.92	P	+
24	大肠埃希氏菌（E. coli, CICC 10303）	624 999.99	P	+
25	大肠埃希氏菌（E. coli, CICC 10304）	23 141.54	P	+
26	大肠埃希氏菌（E. coli, CICC 10361）	1 488.49	P	+
27	金黄色葡萄球菌（S. aureus, CICC 24817）	405.41	P	+
28	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	4.85	P	+
29	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	6.33	P	+
30	芽枝状枝孢霉（C. cladosporioides, CICC 41760）	6.41	P	+
31	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	4.88	P	+
32	绳状青霉（P. funiculosum, CICC 40279）	5.37	P	+

Tab. 9

Tab. 10

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序号	试验菌株	荧光信号比值（样品RLU/培养基空白RLU）
序号	试验菌株	30 ℃	28 ℃	25 ℃
1	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	1.74	1.34	1.31
2	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	1.98	1.85	1.71
3	宛氏拟青霉（P. variotii, CICC 4025）	4.73	3.65	3.28
4	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	1.62	1.43	1.38
5	芽枝状枝孢霉（C. cladosporioides, CICC 41760）	4.89	5.21	13.44
6	反色枝孢霉（C. inversicolor, 10073）	0.99	1.11	3.54
7	黄色枝孢霉（C. xanthochromaticum, CICC 41761）	3.67	4.23	9.41
8	耐盐枝孢霉（C. halotolerans, CICC 2443）	4.86	5.45	8.22

序号	试验菌株	荧光信号比值（样品RLU/培养基空白RLU）
序号	试验菌株	pH 5.6	pH 6.5	pH 7.0
1	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	10.06	3.01	2.84
2	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	2.18	1.75	1.71
3	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	2.61	1.32	2.79

序号	试验菌株	荧光信号比值（样品RLU/培养基空白RLU）
序号	试验菌株	0 g/L	1 g/L	5 g/L
1	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	2.18	1.56	1.57
2	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	2.61	3.02	4.25

序号	培养基种类	培养基pH	培养基空白RLU	接种样品RLU	荧光信号比值（样品RLU/培养基空白RLU）	结果
1	MTAT	7	204	107 025	524.63	P
2	TLE	5.6	91	224	2.46	N
3	TLE	6.5	122	302	2.48	N
4	TLE	7	133	443	3.33	P

序号	试验菌株	培养温度/℃	培养基空白RLU	接种样品RLU	荧光信号比值（样品RLU/培养基空白RLU）	结果
1	迟缓芽胞杆菌（B. lentus, CICC 10365）	30	205	107 025	524.63	P
		32.5	205	99 999 999	487 804.87	P
		35	205	99 999 999	487 804.87	P
2	藤黄微球菌（M. luteus, CICC 10269）	30	205	16 425	80.12	P
		32.5	205	1 293 253	6 308.55	P
		35	205	3 805 765	18 564.71	P
3	荧光假单胞菌（P. fluorescence, CICC 21620）	30	205	99 999 999	487 804.87	P
		32.5	205	99 999 999	487 804.87	P
		35	205	173	0.84	N

Establishment and feasibility study of a dual enrichment system for amplified ATP bioluminescence microbial detection assay in cosmetics

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序号	试验菌株	荧光信号比值（样品RLU/培养基空白RLU）	结果
1	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	8.87	P
2	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	4.51	P
3	宛氏拟青霉（P. variotii, CICC 4025）	6.58	P
4	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	7.90	P
5	芽枝状枝孢霉（C. cladosporioides, CICC 41760）	7.20	P
6	反色枝孢霉（C. inversicolor, 10073）	4.55	P
7	黄色枝孢霉（C. xanthochromaticum, CICC 41761）	10.57	P
8	耐盐枝孢霉（C. halotolerans, CICC 2443）	7.89	P

破壁方法	试验菌株	培养基空白 RLU	接种样品 RLU	比值（样品RLU/培养基空白RLU）	结果
方法1	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	111	415	3.74	P
	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	111	382	3.44	P
	芽枝状枝孢霉（C. cladosporioides, CICC 41760）	111	516	4.65	P
	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	111	361	3.25	P
方法2	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	111	539	4.86	P
	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	111	703	6.33	P
	芽枝状枝孢霉（C. cladosporioides, CICC 41760）	111	712	6.41	P
	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	111	542	4.88	P
方法3	拜耳接合酵母（Z. bailli, CICC 1281）	111	557	5.02	P
	聚多曲霉（A. sydowii, CICC 40930）	111	772	6.95	P
	芽枝状枝孢霉（C. cladosporioides, CICC 41760）	111	626	5.64	P
	树脂枝孢霉（A. resinae, CICC 41706）	111	654	5.89	P

产品批次		洗发水			沐浴液			护发素			定型水			面霜			面膜
产品批次		1	2	3	1	2	3	1	2	3	1	2	3	1	2	3	1	2	3
培养基空白RLU值		157			236			174			127			154			150
微生物对照	A. niger	P			P			P			P			P			P
	C. albicans	P			P			P			P			P			P
	B. subtilis	P			P			P			P			P			P
	P. aeruginosa	P			P			P			P			P			P
	S. aureus	P			P			P			P			P			P
	E. coli	P			P			P			P			P			P
产品样品RLU值		157	144	141	183	187	184	153	217	221	149	173	160	143	185	203	161	190	194
微生物样品	A. niger	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P
	C. albicans	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P
	B. subtilis	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P
	P. aeruginosa	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P
	S. aureus	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P
	E. coli	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P	P

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